免疫組化實驗中如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?

1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案：

(1)游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置時用透析法或?qū)游龇ǚ蛛x熒光素標記的二抗和游離的二抗。購買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。

(2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。

(3)組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長血清封閉時間。

(4)從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

(5)抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。

(6)熒光素不純、標本固定不當?shù)取?/p>

(7)一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時間。

2、陰性染色產(chǎn)生的原因有：

(1)一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。

(2)熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。

(3)血清封閉時間過長。

(4)抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應(yīng)。

(5)組織切片不平、裂片或脫片很嚴重，易引起大塊陰性著色。

(6)組織標本不新鮮或已經(jīng)冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達的部位陰性染色或弱著色。

(7)熒光顯微鏡不會使用，激發(fā)波長選擇錯誤。

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