檸檬酸合成酶（CS）測(cè)定試劑盒

（citroyl synthetase Kit）

一、技術(shù)背景：

檸檬酸合成酶，即 citroyl synthetase，又稱檸檬酸縮合酶，

在三羧酸循環(huán)（又稱檸檬酸循環(huán)）中有非常重要的作用，因

為它催化的反應(yīng)是關(guān)鍵步驟。而三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)

普遍存在的代謝途徑，是三大營(yíng)養(yǎng)素糖類、脂類、氨基酸代

謝聯(lián)系的樞紐和最終代謝通路。

三羧酸循環(huán)（英語(yǔ)：Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle），

或檸檬酸循環(huán)（Citric acid cycle）或克雷伯氏循環(huán)（Krebs

Cycle），是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，因?yàn)樵谶@個(gè)

循環(huán)中幾個(gè)主要的中間代謝物是含有三個(gè)羧基的檸檬酸，因

此得名；或者以發(fā)現(xiàn)者漢斯·阿道夫·克雷伯命名為克雷伯氏循

環(huán)，簡(jiǎn)稱克氏循環(huán)（Krebs cycle）。三羧酸循環(huán)是三大營(yíng)養(yǎng)素

（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，又是糖類、脂類、

氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。

在三羧酸循環(huán)中，反應(yīng)物葡萄糖或者脂肪酸會(huì)變成乙酰

輔酶 A。這種“活化醋酸"（一分子輔酶和一個(gè)乙?；噙B），

會(huì)在循環(huán)中分解生成最終產(chǎn)物二氧化碳并脫氫，質(zhì)子將傳遞

給輔酶煙-酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黃素腺嘌呤（FAD），

使之成為 NADH + H+和 FADH2。NADH + H+和 FADH2 會(huì)

繼續(xù)在呼吸鏈中被氧化成 NAD+和 FAD，并生成水。這種受

調(diào)節(jié)的“燃燒"會(huì)生成 ATP，提供能量。

真核生物的線粒體和原核生物的細(xì)胞質(zhì)是三羧酸循環(huán)的

場(chǎng)所。它是呼吸作用過(guò)程中的一步，但在需氧型生物中，它

先于呼吸鏈發(fā)生。厭氧型生物則首先遵循同樣的途徑分解高

能有機(jī)化合物，例如糖酵解，但之后并不進(jìn)行三羧酸循環(huán)，

而是進(jìn)行不需要氧氣參與的發(fā)酵過(guò)程。

在三酸酸循環(huán)第一步反應(yīng)中，催化乙酰輔酶 A 的乙基與

草酰乙酸的酮基結(jié)合生成檸檬酰輔酶 A，以便后續(xù)高能硫酸

鍵水解，釋放出輔酶 A，得到檸檬酸。檸檬酸合成酶是一個(gè)

調(diào)控酶，此酶的底物乙酰輔酶 A 和草酰乙酸是它的激活劑，

NADH、琥珀酰輔酶 A 是抑制劑。

三、所需儀器：

酶標(biāo)儀（412nm）、微量移液器、漩渦混勻器、高速離心

機(jī)、37℃水浴/氣浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、研缽或高速組織分

散器（勻漿機(jī)）、冰、雙蒸水、離心管（1.5mL 或 2mL）。

四、試劑組成及配制：（A108-1-1 20T）

㈠、前處理試劑：

提取液 20mL×1 瓶，4℃保存。

沖洗液 50mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反應(yīng)試劑：

試劑一：緩沖液 4mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：底物液 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑三：顯色劑 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑四：陰性對(duì)照液：0.2mL×1 支，4℃避光保存。

五、試劑組成及配制：（A108-1-2 50T）

㈠、前處理試劑：

提取液 50mL×1 瓶，4℃保存。

沖洗液 100mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反應(yīng)試劑：

試劑一：緩沖液 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：底物液 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑三：顯色劑 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑四：陰性對(duì)照液：0.5mL×1 支，4℃避光保存。

六、試劑盒存放：

本．試．劑．盒．收．到．后．按．規(guī)．定．條．件．存．放．，．有．效．期．6．個(gè)．月．。．

七、友情提醒：

本試劑盒內(nèi)所有試劑僅限于科學(xué)研究使用，不得用于臨

床診斷及藥物治療等。

八、操作步驟：

1、樣本前處理：

A）方法一：液氮研磨

①、樣本準(zhǔn)備：取出新鮮組織或冷凍組織（4℃解凍或室

溫解凍），用沖洗液沖洗干凈，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取

組織重量 100～300mg,加入液氮，快速用研磨棒碾

碎組織成粉末狀，備用。

②、10%待測(cè)懸液制備：取研磨后組織粉末稱重置于離

心（1.5mL 或 2mL）管中，并按重量(g)：體積(mL)=1：

9 的比例加入 9 倍體積的提取液，渦旋混勻器劇烈

混勻 30 秒，間隔 2 分鐘，重復(fù)操作 2～3 次，制備

10%待測(cè)懸液。放回冰槽環(huán)境回溫。

③、離心處理：將裝有 10%待測(cè)懸液的離心管置于 4℃

臺(tái)式離心機(jī)，10000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心 10 分鐘。

④、10%待測(cè)上清制備：取出離心管置于冰槽環(huán)境，小

心吸取 10%待測(cè)上清液轉(zhuǎn)移到新離心管（1.5mL 或

2mL）待測(cè)，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)試劑（或 BCA 試劑）

測(cè)定蛋白濃度（本所有售）。

B）方法二：機(jī)械勻漿（如不具備液氮操作條件）

①、10%待測(cè)懸液制備： 取出新鮮組織或冷凍組織（4℃

解凍或室溫解凍）,用沖洗液沖洗干凈,濾紙吸干；準(zhǔn)

確稱取組織重量，按重量（g）：體積(mL)=1:9 的比

例，加入 9 倍體積的提取液，冰水浴條件下機(jī)械勻

漿，制備成 10%待測(cè)懸液。

②、離心制備 10%待測(cè)上清：10000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，

吸取上清即為 10%的待測(cè)上清液。同時(shí)用考馬斯亮

藍(lán)試劑（或 BCA 試劑）測(cè)定組織蛋白濃度。

2、操作步驟：

⑴、儀器準(zhǔn)備：

將酶標(biāo)儀設(shè)定到待測(cè)波長(zhǎng)（412nm），預(yù)溫 30min，

使之各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)處于較穩(wěn)定使用狀態(tài)。

⑵、試劑準(zhǔn)備：

將冷凍試劑（底物液、顯色劑）與冷藏試劑（緩沖

液、陰性對(duì)照液）取出，平衡至室溫后使用。

⑶、樣本準(zhǔn)備：

將待測(cè)樣本置于冰槽回溫平衡后待測(cè)。

⑷、反應(yīng)步驟（96 孔板操作）：（附贈(zèng) 96 孔板 1 塊）

a、取干凈無(wú)菌 96 孔酶標(biāo)板，置于試驗(yàn)臺(tái)水平放置

并標(biāo)記待測(cè)樣本編號(hào)，即 U 孔（或陰性對(duì)照孔，

即 O 孔）；

b、加入試劑一（緩沖液）190μL 于 96 孔酶標(biāo)板 U

孔（或 O 孔）中；

c、加入試劑二（底物液）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

d、加入試劑三（顯色劑）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

e、將加入上述試劑 96 孔酶標(biāo)板輕搖混勻并置于

37℃孵育箱 3～5min；

f、取出裝有預(yù)溫試劑的 96 孔酶標(biāo)板，水平置于試

驗(yàn)臺(tái)；

g、加入待測(cè)樣本 10μL 于上述 U 孔中（或陰性對(duì)

照液 10μL 于 O 孔中）（待．測(cè)．樣．本．須．澄．清．，．凍．存．

后．復(fù)．溶．樣．本．據(jù)．情．況．需．離．心．除．去．析．出．蛋．白．后．再．

用．）；

h、輕搖該酶標(biāo)板，使待測(cè)樣本（或陰性對(duì)照液）

與預(yù)溫試劑充分接觸；并將該操作 96 孔酶標(biāo)板

轉(zhuǎn)入酶標(biāo)儀，波長(zhǎng) 412nm，測(cè)定待測(cè)樣本吸光

度 OD 值，記為 AU0（陰性對(duì)照孔為 AO0）；

i、將該 96 孔酶標(biāo)板轉(zhuǎn)入 37℃孵育箱（或者在 37℃

恒溫酶標(biāo)儀）中溫浴 15min；

j、再將該操作 96 孔酶標(biāo)板轉(zhuǎn)入酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)

412nm，測(cè)定待測(cè)樣本吸光度 OD 值，記為 AU15

（陰性對(duì)照孔為 AO15）；；

k、待測(cè)樣本值（U 孔）：待測(cè)樣本吸光度 AU15— 待

測(cè)樣本吸光度 AU0。

【陰性對(duì)照值（O 孔）：AO15-AO0】

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